Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒實驗原理

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒說明書

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒AlamaBlue 細胞活力檢測試劑盒提供了一種可靠、靈敏、安全和低成本的快速有效檢測細胞活力與毒性的方法。AlamaBlue 通過在細胞生長的培養基中所產生的化學還原反應，將非熒光信號的染料轉換成為一紅色熒光物質，試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），從而檢測細胞的存活率。維持細胞需要還原性環境而抑制生長則表現為氧化型環境。細胞生長率相關的降低可表現為氧化還原指示劑從氧化型（非熒光素、紫色）轉為還原型（熒光素、紅色）。該熒光信號可以用530~560nm 的激發波激發，在590nm 處可以獲發射波，檢測570 和600nm 的的吸光度值，校正監測值，可以減去相應的570nm 和600nm 的背景吸光度值。檢測所產生的熒光信號是與樣品中的活細胞數成正比的。

AlamaBlue 細胞活性檢測試劑盒的靈敏度相似于[3H]胸苷法檢測細胞增殖法。根據不同類型的細胞，AlamaBlue 可以檢測到至少40個細胞，同時保證很好的重現性和靈敏度。作為試鹵靈（紫紅、紅色熒光）可以進一步被還原為水解化的試鹵靈（無色、無熒光），當細胞數量增多，所有的刃天青（7-羥基-3-羰基-10-氧化-三氫吩惡嗪）被轉換為試鹵靈（9-羥基-3-異吩惡嗪酮7-羥基-3H-吩惡嗪-3-酮），試劑盒的信號反而會發生衰減。因此，對于您所用的試劑盒來說，針對不同的細胞類型，應該調整您的細胞數，做相應的優化，才能得到更好的結果。

操作說明

以下操作可用作通用指導建議。考慮不同細胞類型與培養條件的差異性，有必要根據實際情況優化您的操作步驟。

1. 96 孔細胞培養板每孔100μL 培養基飼養細胞，控制細胞數目在40~10000 個/貼壁細胞，2000~500000 個/懸浮細胞。設置空培養基做對照。

2. 加入10μL AlamaBlue 溶液至培養基中，37 度孵育：24 小時（比色法讀數）；5-6 小時（熒光讀數）。

3. 檢測570nm 和600nm 的吸光度，或者用熒光微孔板讀數530nm 激發，590nm 發射波讀數。

4. 如果采用比色法檢測，選擇OD570-OD600 檢測，如果檢測熒光信號，請在校正OD 值后，先設置標準曲線，選擇合適您實驗的細胞最佳濃度。

Alarma Blue細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒注意事項：

1、懸浮細胞用此法時必須經離心后才能吸出上清再加DMSO。

2、Formazan 的生成不僅與活細胞數成比例，也受作用時間的影響，因此當樣品較多時測定的OD 值可能隨時間而變。

3、MTT 溶液為黃色，需避光保存，長時間光照會導致失效。當顏色變為灰綠色時，請勿使用。MTT 溶液在4℃或較低溫度情況下會凝固，可以20-25℃水浴溫育片刻至全部融解后使用。

4、為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

操作規程

1、在96孔板加入細胞100μL/孔，通常細胞增殖實驗每孔加入100微升2000個細胞，細胞毒性實驗每孔加入100微升5000～10000個細胞（具體每孔所用的細胞的數目，需根據細胞的大小，細胞增殖速度的快慢等決定）。置37℃ 5%CO2細胞培養箱培養24小時.

2、.加入適當濃度的0～10μL 受試化合物。

3、將96孔板在37℃，含5% CO2空氣及100%濕度的細胞培養箱中孵育適當時間。

4、將5×MTT 用稀釋液稀釋成1× MTT 溶液。

5、每孔加50μL 1× MTT 溶液，在37℃孵育4小時，使MTT 還原為甲臜。

6、吸出上清液，每孔加150μL DMSO 使甲臜溶解，用平板搖床搖勻。

7、酶標儀在570nm 波長處檢測每孔的光密度（如無570nm 濾光片，可以使用560-600nm 的濾光片）。

8、結果分析

 a、細胞的存活率：將各測試孔的OD 值減去本底OD 值（*培養基加MTT，無細胞）或空白藥物孔OD 值（*培養基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞），各重復孔的OD 值取平均數±SD。細胞的存活率以T/C%表示，T 為加藥細胞的OD 值，C 為對照細胞的OD 值。細胞存活率% =（加藥細胞OD/對照細胞OD）×100

試劑盒使用注意說明：

1.由于現有條件及科學技術水平尚不能對所有供貨商提供的所有原料進行全面的鑒定與分析，本產品可能存在一定的質量技術風險。

2.最終的實驗結果與試劑的有效性、實驗者的相關操作以及當時的實驗環境密切相關，請務必準備充足的標本備份。

3.不同批次的同一產品可能會有少許差別，如：檢測限、靈敏度以及顯色時間等，請依據試劑盒內說明書進行實驗操作，網站電子版說明書僅作參考。

4.只有全部使用本試劑盒配套試劑才能保證檢測效果，不能混用其他商的產品。只有嚴格遵守本試劑盒的實驗說明才會得到最佳的檢測結果。

5.本公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

6.使用化學裂解液制備的組織勻漿或細胞提取液可能會由于某些化學物質的引入導致ELISA實驗結果偏差。

7.若樣本為細胞培養上清，因該類樣本干擾因素較多，如：細胞狀態、細胞數量、采樣時間等，所以可能存在檢測不出的情況。

8.某些天然蛋白或重組蛋白，包括原核及真核重組蛋白，可能因為與本產品所使用的檢測抗體及捕獲抗體不匹配，而不被檢測出。